高比例胚胎干细胞嵌合体猴诞生 非人灵长类疾病模型迎来新突破

【新知】

◎本报记者 朱 丽

曾培育出首个体细胞克隆猴的科研团队，再次迎来新突破。

历时5年攻关，由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心牵头的联合团队，在国际上首次成功构建高比例胚胎干细胞贡献的出生存活嵌合体猴。该成果以封面文章形式发表在国际期刊《细胞》上。

之前，人们已经在小鼠和大鼠中成功构建嵌合体，但迄今为止还未在包括非人灵长类动物在内的其他物种身上有效实现相关技术。中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心学术主任蒲慕明院士评价，这一成果对于生物医药研究的重要性不亚于克隆猴技术，是构建非人灵长类疾病模型的里程碑成果。

科学家为何对之孜孜以求

在揭开嵌合体猴的神秘面纱之前，要先认识一下胚胎干细胞。

“在囊胚期，我们不让内细胞团在子宫内着床，而是进行体外分离并在培养皿中对细胞进行扩增，并最终获得胚胎干细胞。”论文通讯作者、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心研究员刘真介绍，胚胎干细胞是生命发育早期的“种子”细胞，不仅可以实现体外无限复制，还能在改变培养条件的情况下被诱导分化成不同组织的细胞，在模式动物构建、细胞治疗、器官再生、类器官模型等方面发挥着重要作用。

刘真表示，此次研究的首要问题是要获得具有高效发育潜能的胚胎干细胞。而通过胚胎注射形成拥有不同基因型的生物嵌合体，是评估胚胎干细胞多向分化潜能的金标准。

几十年来，科学家对此孜孜以求。胚胎干细胞的发育多能性此前已在啮齿类动物中得到了证明。1984年，科学家首次实现小鼠胚胎干细胞胚胎注射形成嵌合体小鼠。2008年，科学家又成功构建了胚胎干细胞嵌合体大鼠。

小鼠大鼠与人在身体结构、功能等方面存在明显差异，而非人灵长类动物与人最为接近，因此研发非人灵长类胚胎干细胞嵌合体技术对于脑科学和生物医药研究具有非常重要的意义。

找到成功嵌合的“金钥匙”

灵长类动物胚胎干细胞究竟能否高效形成嵌合体？在这一问题上，一直没有确切答案。

刘真说，经典的人和猴的胚胎干细胞不易形成嵌合体。灵长类的胚胎干细胞需要的培养条件比小鼠更复杂，因此，改善培养条件非常关键。

研究团队建立了处于6种不同培养体系下的食蟹猴胚胎干细胞，在进行全面系统的评估后，发现4CL体系培养的干细胞具有更好的传代稳定性和基因组稳定性。迈过第一关后，第二关则是影响成功嵌合的关键——胚胎干细胞注射入其他受体胚胎后，容易快速凋亡。也正因此，国内外的相关研究一直进展缓慢。

猴的胚胎和胚胎干细胞的培养条件完全不同。研究团队测试了干细胞注射入胚胎后的不同培养基和培养时间的组合，历经多次实验、不断纠错，最终找到了既不影响胚胎正常发育，又能保证干细胞存活的最优嵌合胚胎培养条件。

2021年初，研究人员将筛选出的干细胞注射到发育仅4—5天的猴子胚胎中，并将74个具有明显嵌合的囊胚移植到40只受体雌猴体内，最后获得了4只流产的胚胎和6只出生存活猴。其中，有一只出生存活猴和一只流产猴检测到明显的嵌合。

研究人员确认，在出生存活猴大脑、心脏、肾脏、肝脏和胃肠道中都含有干细胞来源细胞的组织类型，在测试的26种不同组织类型中，干细胞来源细胞的组织占比平均为67%。研究表明，注射的胚胎干细胞可以跟受体胚胎细胞同步分化到出生个体猴的各种不同细胞谱系中。此外，这一研究还证实猴胚胎干细胞可以高效地贡献到胚外胎盘组织和生殖细胞。

为人类疾病研究奠定基础

曾有美国科学家发表论文称，猴胚胎干细胞不能产生嵌合体。几年前，有中国科学家证明猴多能干细胞能够产生嵌合体，但其嵌合体效率仅为0.1%—4.5%。如今，这只高比例胚胎干细胞嵌合体猴的诞生让人们对这一问题有了更加清晰的认识。

学术同行认为，该研究将为基础研究和非人灵长类遗传修饰模型的产生开辟新的途径。利用胚胎干细胞来实现基因修饰的能力将使目前在受精卵或胚胎阶段使用基于CRISPR的技术难以完成的研究成为可能。

“相比现有的转基因猴模型，使用嵌合体猴技术有望获得没有个体差异的批量的疾病猴。”蒲慕明表示，对于单个基因突变造成的疾病，比如渐冻症，如果有了更好的疾病模型猴，人们就可以对其采取干预、开展新药研发。当嵌合体猴实现批量培育，建立相应模型就指日可待了。

刘真表示，下一步他们要通过进一步改进培养条件来提升胚胎干细胞的潜能，以及干细胞植入囊胚后的存活率，从而提高嵌合体猴的培育效率。

“小鼠的出生周期仅20天，猴子则需5个半月。小鼠出生后2个月就能性成熟，既可以传代也可以用于科学研究。猴子可能需要5年才能性成熟。我们可以将猴的胚胎发育和生殖发育的研究时间缩短到1年半，这已经是目前可以做到的最好程度。”刘真深知，与小鼠相比，嵌合体猴确实面临更多的困难，“当前，我们重点关注模型技术的研发和构建，以及下游的表型分析，疾病的药物测试、认知研究等。”

多位专家表示，现有研究成果对于理解灵长类胚胎干细胞全能性和发育潜能有着重要意义，为建立基于猴胚胎干细胞嵌合体的基因打靶和模型构建技术奠定了基础。

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